非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验步骤

1、PAGE胶电泳缓冲液配置1)丙烯酰胺单体贮液:14.55g丙烯酰胺加上0.45g N,N’-甲叉双丙烯酰胺,先用40mL双蒸水搅拌溶解,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀至50mL,过滤。

用棕色瓶4°C保存备用。

2)浓缩胶缓冲液贮液(0.5mol/L Tris-HCl,pH6.8):3.03gTris溶解在40mL双蒸水中,用4mol/L盐酸调pH6.8。

再用双蒸水稀至50mL。

保存在4°C备用。

3)分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl,pH8.9):18.16gTris溶解在80mL双蒸水中,用4mol/L盐酸调pH8.9。

再用双蒸水稀至100mL,保存在4°C备用。

4)10%(AP)过硫酸铵:0.1g过硫酸铵溶入1.0mL双蒸水,使用前新鲜配制。

5)电极缓冲液(0.025mol/L Tris,0.2mol/L甘氨酸,pH8.3):15.14gTris加上72.07g甘氨酸,用双蒸水稀释到5L。

可在室温保存一个月。

6)样品缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl,pH6.8):2ml浓缩胶缓冲液贮液加上1mL87%甘油、0.1mg溴酚蓝,用双蒸水稀释至10mL,可在-20°C保存6个月。

2、Native-PAGE配方 分离胶: 双蒸水 6.6ml 30%丙烯酰胺溶液 8.0ml 1.5mol/L Tris(pH8.8) 5.0ml 10%过硫酸铵溶液 (W/V) 200μl TEMED 15μl 浓缩胶: 双蒸水 6.8ml 30%丙烯酰胺溶液 1.7ml 0.5 mol/ LTris(pH6.8) 1.25ml 10%过硫酸铵溶液 (W/V) 100μl TEMED 10μl 3、Native-PAGE电泳将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净,用酒精棉球擦拭,将电泳槽安装好,配制分离胶(12%)和浓缩胶(5%)如表1。

过硫酸铵和TEMED最后加入,加入后聚合即开始,应立即混匀倒入两块玻璃板之间。

分离胶倒入两块玻璃板间,应该留下适合的高度,使点样孔前端离分离胶有2.5cm左右的距离,在胶顶部缓缓加入约0.5cm高的双蒸水,待分离胶聚合完全后,倾去上层的双蒸水,用双蒸水清洗凝胶顶层,用吸水纸吸去残余的水滴。

将浓缩胶倒入玻璃板夹层,插上梳子,待浓缩胶聚合完全后,拔去梳子,立即用双蒸水清洗点样孔。

加入电极缓冲液,将样品用微量进样器点入点样孔底部,200伏电泳。

当溴酚蓝到达分离胶时,电压改为250伏,继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。

将凝胶剥下,浸泡在100ml的底物液中,染色1小时,待胶带显色后立即照相。

然后将凝胶进行常规的考马斯亮蓝染色。

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