在分子荧光分析过程中应注意哪些问题?

1 做荧光定量PCR之前,考虑到的是你能接触到什么机型的PCR仪,不同的PCR仪兼容的耗材以及试剂不一样的,如果你没有别人带,自己第一次做,一定要注意。

2 做荧光定量PCR最重要的莫过于,引物和模板的准备。

提取RNA之后一定要电泳检测其降解状态,如果发生了降解很容易导致结果偏差;引物设计的好坏直接关系着后续实验的成功,所以引物合成回来,可以做个普通的pcr,跑电泳验证其特异性。

如果同时要检测很多的基因,那么设计的时候,引物的Tm最好都相近在60度左右,扩增产物150bp左右最好,有利于操作。

3 荧光定量PCR的体系确定,大的体系容错率可能稍微高一点,小的体系对操作的精度和准度要求比较高,但是可以很好的的节省cDNA模板。

如果没有电动的分液枪,要熟练的使用普通移液器。

4 进行具体实验之前,要测定引物的扩增效率,通常来说,比较两种处理中基因表达的差异是需要内参基因的,这样的比较,是假定兴趣基因引物以及内参基因的扩增效率相同且为1的。

如果引物太多,可以看荧光定量PCR的扩增曲线,如果形态相近的话,一般也认为扩增效率是一致的。

5 荧光定量PCR最少设置三个技术性重复组,同时一定要有空白对照组,有很多人没有这种习惯,其实很危险。

6 荧光定量PCR的程序和普通PCR不同,会多一个melting的部分,同时三步循环中延伸的部分可以去掉,节省时间。

7 荧光定量PCR结束之后要去看下溶解度曲线,每种扩增产物的曲线为单峰既Ok8 数据的处理,这部分首先要根据sd值判断数据质量。

如果重复组数据波动很大,则会导致结果不可信,当然如果设置的重复组较多,有些明显的单个异常值可以去掉,优化数据。

最后需要根据不同的目的来对数据进行不同的计算处理。

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